1、原理:
首先通过微孔滤膜法过滤水样浓缩样品,将浓缩后的样品通过密度梯度离心进行分离纯化,然后将纯化后的样品经免疫荧光染色,通过荧光显微镜对贾第鞭毛虫孢囊进行定性分析和定量检测。具有高藻、高有机质和高絮凝剂含量的水源水样本应先进行前期处理。
2、采样:
微孔滤膜过滤法(适用于浑浊度小于 20 NTU 的水样),即生活饮用水,采样宜采集50L;样品采集后若不能立即处理,可于1℃~10℃冷藏保存,在72h内进行浓缩处理。
3、样品浓缩
①将不锈钢过滤器通过软管经蠕动泵和水样相连。将混合纤维素酯微孔滤膜正面向上置于过滤装置上,用纯水淋洗滤膜使滤膜与滤器间无气泡,安装好过滤器。打开蠕动泵过滤水样。若过滤压力过大(流速低于 0.3L/min 时),可更换新的滤膜重复上述步骤。水样过滤完之后,依次用约200ml的PBST、75%乙醇和纯水清洗采样桶,并将清洗液过滤。过滤结束后,打开过滤装置,使用平头镊子将滤膜正面向内多次对折,将折叠好的滤膜置于50ml的锥形底离心管中。若使用多张滤膜,可放置于同一50ml锥形底离心管中。
②向上述50ml锥形底离心管中加入丙酮至40ml,摇晃混匀使滤膜完全溶解。将溶解液分装进4个15ml离心管中,在1050g条件下离心10min(勿用制动器,减速度为0)。离心结束后,用吸管吸去上清液,留下沉淀物。再次向50ml锥形底离心管中加人40ml丙酮进行混匀,混合液分装至上述4个15ml离心管中,混后在1050g、20℃条件下离心10min(勿用制动器,减速度为0)。离心结束后,用吸管吸去上清液至盛水的烧杯中,检查上清液是否因含混合纤维素酯滤膜而遇水后生成白色絮体。如有,再次向有白色絮体的15ml离心管中添加丙酮并离心去上清液直至上清液遇水无白色絮体生成。
③向上述4个15 ml离心管离心后的沉淀物中分别加人 1.25 ml75%乙醇,轻轻混匀,再缓慢加人PBS至10ml。2000g、20℃条件下离心10min(勿用制动器,减速度为0)。离心后吸去上清液,保留沉淀物。记录4个15ml离心管中沉淀物的总体积为V。
④若沉淀物总体积V小于或等于2ml,向上述4个15ml离心管浓缩后的沉淀物中各加入2.5ml的PBST,置于涡旋振荡器上振荡1min混匀。并且记录该样品的V1=V。
⑤若沉淀物总体积V大于2ml,向上述4个15ml离心管浓缩后的沉淀物中需各加人的PBST体积为1.25倍的V。置于涡旋振荡器上振荡1min混匀。将4个15ml离心管中的混合液分装至多个15ml离心管,保证每个离心管内样品体积不超过3ml。该样品用于后续分离纯化和染色镜检的离心管数量最好大于或等于4个,V1为用于后续分离纯化和染色镜检的液体体积的1/6。
水样大于10L时,根据水样体积重复步骤①②③,并根据15ml离心管中沉淀物的体积选择步骤④或⑤进行沉淀物重悬。