微生物学中将在实验条件下从一个单细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养(purecultivation)。获得微生物纯培养是利用和研究微生物的基础，常用的分离获得微生物纯培养的方法有以下几种。

1、稀释平皿法

首先将待测样品用无菌水制成一系列的稀释梯度，如10^-1、10^-2、10^-3、10^-…取最后3个稀释度、通常细菌取10^-4～10^-6，放线菌取10^-3～10^-5、霉菌取10^-2～10^-4。以倾注平皿法或涂布平板法接种于合适的培养基，每个稀释度做3～5个平行。将接种后的平板培养一段时间后即可有菌落出现，取稀释得当的平板，也就是在平板上出现单个的分散的菌落，这个菌落可能就是由一个微生物细胞繁殖形成的，挑取该单菌落，即可得到纯培养。

2、划线法

将样品用无菌水制成较高浓度的菌悬液待用，培养基熔化后倒入平皿冷却凝固制成平板用，接种环在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入平板内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 2～3条，转动培养皿约70°角，接种环灼烧灭菌后，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。划线的方法包括分区划线法和连续划线法两种。

3、单细胞挑取法

单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装于显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上，用装于显微挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准一个单独的细菌细胞挑取，再接种于平板上培养而得到纯培养。此法常用于真菌单孢子的分离，对操作技术要求较高。

4、选择培养基法

不同种类的微生物对营养物质的要求不同，对不同的环境条件如温度、pH、氧气等要求也有很大的不同，并且对不同的物质如消毒剂、抗生素、染料等也具有不同程度的抵抗能力。因此，利用这些特性，便可配制各种选择性培养，从而抑制不需要的微生物的生长而把某种微生物分离纯化出来。如含有1:50000～1:20000结晶紫的培养基能抑制大多数革兰氏阳性菌的生长，在培养基中加入链霉素可抑制许多原核微生物的生长。

在分离某些植物或动物病原菌时，可先将其接种至敏感宿主体内，侵染后，宿主的某些组织中可能只含该种微生物，这样容易得到纯培养。也可以通过对样品进行处理，以消除不需要的微生物。如从样品中分离芽孢细菌，可将样品用适当高温处理一段时间，以杀死所有的非芽孢细菌，芽孢存活下来，继续培养便可获得芽孢菌的纯培养。对一些在样品中数量较少的微生物的分离，可先进行富集培养，以帮助所需要的微生物的生长，从而容易得到所需要的纯培养。