现行GB4789.9-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》(以下简称GB4789.9法)中使用Bolton肉汤增菌,改良CCD和Skirrow血琼脂分离培养,如样品杂菌严重较难分离到弯曲菌,我国很多地区禽肉样品中空肠弯曲菌的检出率低于10%,严重低估了我国空肠弯曲菌食品污染的疾病负担。2019年中华预防医学会发布了T/CPMA 006-2019《空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法》团体标准(以下简称T/CPMA 006法),主要以增菌后过滤培养为基础,提高了食品样本中空肠弯曲菌的检出率,部分实验室采用T/CPMA 006标准方法对禽肉类空肠弯曲菌的分离率可达27%~75%。
据文献报道,深圳市南山区疾病预防控制中心采集2020年11-12月深圳市某市场39份贝类海鲜样品,采购青岛中创汇科生物科技有限公司改良CCD琼脂,Skirrow血琼脂,双孔滤膜法双孔板等进行GB4789.9法与T/CPMA006法检测空肠弯曲菌效果的比较实验。
1、实验内容:
采用GB4789.9和T/CPMA 006的2种标准方法对贝类海鲜进行空肠弯曲菌的分离,并通过模拟样品获得海鲜样品中弯曲菌的最低检出浓度和检出率,同时应用MALDI-TOF和荧光PCR作为空肠弯曲菌的验证和辅助检测。
2、样品来源:
采集2020年11-12月深圳市某市场39份贝类海鲜样品、空肠弯曲菌标准菌株ATCC33560;
3、仪器与试剂:
改良CCD琼脂(青岛中创汇科生物),Skirrow血琼脂(青岛中创汇科生物),双孔滤膜法双孔板(青岛中创汇科生物),质谱仪(MALDI-TOF,法国生物梅里埃),荧光PCR仪(美国Bio-Rad型号CFX96),智能厌氧系统,PCR Master,引物和探针等;
4、实验方案:
(1)原始样品的阳性检出率:分别用GB4789.9和T/CPMA 006的2种标准方法对采集到的深圳市某市场39份贝类海鲜样品,进行空肠弯曲菌检测;
(2)模拟样本的最低检出浓度:在检测阴性的标本中掺入终浓度分别为100、101、102、103、104、105CFU/g的活菌进行模拟实验,每个浓度模拟3个样品,分析比较2种标准方法的最低检出浓度;
(3)最低检出浓度下的检出率:掺入终浓度分别为103和104CFU/g的空肠弯曲菌活菌,每个浓度各10份样品,比较2种标准方法的检出率差异;
(4)辅助检测:利用MALDI-TOF质谱和荧光PCR作为菌落验证和辅助检测;
5、实验结果:
序号 | 实验内容 | GB4789.9 法 | T/CPMA 006 法 |
1 | 39份原始样品的阳性检出率 | 未检出 | 2.6%(1/39) |
2 | 模拟样本的最低检出浓度 | 103CFU/g | 101CFU/g |
3 | 103 CFU/g模拟样本浓度下的检出率 | 10%(1/10) | 100% |
4 | 104 CFU/g模拟样本浓度下的检出率 | 20%(2/10) | 100% |
6、实验结论:
(1)海鲜中也存在空肠弯曲菌的污染。
(2)与GB4789.9法相比,T/CPMA 006法可显著提高海鲜样品中空肠弯曲菌的检出率,并将最低检出浓度降低2个数量级。
本实验中T/CPMA 006的检测结果优于GB4789.9的原因是T/CPMA 006采用低速离心,可最大限度将样品中的弯曲菌富集,且采用广谱增菌液进行增菌,由于增菌液中加入促生长因子和血液成分,弯曲菌可以得到充分的增菌,最后获得较纯的弯曲菌,便于挑取。而SKIRROW血琼脂和改良CCD琼脂中生长出来的杂菌多,可疑菌落很少,容易漏检。
【参考文献】:刘楚云,马艳萍,段永翔等.海鲜产品中空肠弯曲菌2种检测标准的比较[J].职业与健康,2023年9月第39卷第18期.