【产品名称】兔抗脑膜炎球菌诊断血清试剂（A、B、C、W、X、Y、多价Ⅰ、多价Ⅱ群）

【产品型号】ZC-NMY-001

【包装规格】

【检测原理与用途】

脑膜炎奈瑟菌是引起流行性脑脊髓膜炎的病原菌，根据荚膜多糖的结构多样性脑膜炎奈瑟菌可分为多个血清群。血清学检测的基础是血清中的抗体会与携带同种抗原的细菌发生凝集反应，这些抗体是免疫体在接触细菌抗原后产生的，本产品中的脑膜炎球菌诊断血清均免疫自实验兔。本试剂主要用于A、B、C、W、X、Y群脑膜炎奈瑟菌血清学初步鉴定。本产品为体外诊断试剂，适用于玻片凝集试验。

【贮存条件及保质期】

产品于2℃-8℃保存，需避光，自生产之日起保质期12个月。

注意：在长时间储存过程中，有些血清会变得有点混浊。这种情况为正常现象不会影响结果，血清可在使用前低速离心或膜过滤(0.45µm)进行澄清。

【检测方法】

1. 本产品在使用前，由冰箱拿出，平衡到室温后使用。

2. 样品分离培养物，经鉴定确定为脑膜炎奈瑟菌后，再进行血清分群检测，如果未能确定为脑膜炎奈瑟菌，不宜直接进行血清凝集检测，以免产生假阳性结果。

3. 待鉴定细菌在血平板或巧克力平板上，37℃，5% CO₂，培养18-24小时。

4. 用酒精擦拭载玻片。用蜡笔或防水笔在载玻片上划格分区。

5. 在玻片每格的下半部分，用移液器滴加5%的福尔马林溶液10μL（基于生物安全目的），用无菌或一次性10μL接种环挑取BAP平板上过夜培养的新鲜菌落，在玻片上将细菌与5%的福尔马林溶液混匀，混匀后的液体应该不透明，在加抗血清前应保持细菌悬液不干燥。

6. 在玻片的上方加10μL血清群特异的抗血清，同时在阴性对照侧加PBS或者生理盐水。

7. 也可滴加20μL抗血清在玻片上，挑取新鲜菌落直接与抗血清进行混匀，观察凝集反应。（如采用非灭活菌进行凝集，操作严格遵守生物安全操作规范，在BSL-2级生物安全柜内进行操作）。

8. 缓慢的混合细菌悬液和抗血清，使上部的抗血清和下部的细菌悬液充分混合5分钟。不要做旋转晃动，以免不同血清群的血清会相互混合污染。

9. 在灯光下，黑暗背景条件下5分钟内观察结果。如果超过5分钟，才发生的凝集反应按阴性处理。

10. 建议待检细菌先分别与多价I和多价II抗血清进行凝集反应，如与多价I出现凝集反应阳性，再分别再与A、B、C三个群特异抗血清进行凝集反应；如与多价II出现凝集反应阳性，再分别再与W、X、Y三个群特异抗血清进行凝集反应。

【检验结果的解释】

当抗血清与细菌接触，会引起凝集反应，使细胞（细菌）凝集或呈簇，细胞（细菌）上清液变得清亮，细胞悬液浓度或使用的抗血清浓度不同，会产生不同的强度的凝集反应，见图示

4+ 所有的细胞都发生凝集，细胞悬液清亮。

3+ 75%的细胞发生凝集，细胞上清略微浑浊不清。

2+ 50%的细胞发生凝集，细胞上清略微浑浊不清。

1+ 25%的细胞发生凝集，细胞上清略微浑浊不清。

+/- 少于25%的细胞发生凝集，可见有颗粒状的成分。

0 没有肉眼可见的凝集，上清悬液浑浊、平滑。

【血清群确定】

1. 5分钟内，出现3+或4+凝集为阳性反应（强阳性反应）。对于B群脑膜炎奈瑟菌来说，如果出现2+及以上的凝集则可认为阳性。

2. 阴性反应是+/-、1+凝集程度。

3. 当菌株仅与一种抗血清出现凝集，但和生理盐水不凝集时才能鉴定为该种血清群。

4. 如果不能确定血清群，菌株记为不可分群脑膜炎奈瑟菌（NG）。

5. 关于不可分群脑膜炎奈瑟菌（NG）菌株:

1)在生理盐水中凝集，无论与任何一种抗血清发生强凝集，记为NG。

2)在生理盐水中不凝集，但和多种抗血清发生凝集，记为NG。

3)在生理盐水中不凝集，也不和任何一种抗血清发生凝集，记为NG。

【结果难以判断时的解决方案】

由于脑膜炎奈瑟菌生长状态存在差异性，例如有荚膜与无荚膜，小菌落与大菌落，慢生长与快生长等，有时候可能造成凝集结果难以判断，建议可进行如下补充操作：

l 挑取同一平板上的另一个细菌克隆进行重复凝集试验。

l 如果玻片上的结果不明确，将试管中配置悬液，重复该试验。

l 提取单个菌落转钟，再次做纯培养，第二天重新进行凝集试验。

l 如果当天的平板上由各种大小不一的菌落，每种菌落再次分离纯培养，第二天每种菌落进行试验，大菌落一般会有比较好的凝集反应，小菌落次之，

如果试验中的问题还是不能解决，应当和对照菌株同时进行试验，确保试剂的正确性。

【血清质量控制】

在对未知的菌落进行血清分群之前，应选用一套脑膜炎奈瑟菌参考菌株（A、B、C、W、X、Y）和一株可分群的脑膜炎奈瑟菌进行质量控制检测，操作步骤：

1. 新购进的每一批次抗血清要用参考菌株进行检测。

2. 半年后重复质量控制检测。

3. 如果血清长时间暴露于超过10℃环境，或者怀疑血清被污染时，也要对血清进行重新的质量控制检。

4. 关于血清分群和质量控制，每一批次的抗血清需要使用所有的参考菌株进行实验室验证，记录质量控制验证结果。

【血清质量控制检测结果判读】

1. 通过质量控制检测：与同源性的抗原反应，5分钟内，出现3+或4+程度的凝集；单一血清群的抗血清不与其它血清群的脑膜炎奈瑟菌反应，不与已明确的NG菌株产生凝集反应，盐水不自凝。

2. 分群血清质量控制检测失败：如果抗血清与一种或多种参考菌株凝集反应，或/和NG参考菌株反应，盐水自凝，则血清不能使用。

【注意事项】

1. 仅供科学研究使用。

2. 全部样本、微生物培养物和接种产品都应该视为具有感染性，由受过训练的技术人员操作。在整个操作中，应该遵循无菌操作技术和常规处理菌群的注意事项。

3. 操作过程中不慎有血清洒出，应立即用吸水纸擦拭可能污染的区域，并用标准的细菌消毒剂或70%的酒精擦洗污染区域。用于清洁溢出物的所有材料，应作为生物危险废物处理。

4. 非一次性器具在使用后应在121℃下高压至少15分钟。一次性器具应高压灭菌或焚烧处理。

5. 不要使用超过有效期及不符合标准规定颜色的诊断血清。避免抗血清的微生物污染，会导致产品失效出现错误的结果。

6. 使用前，血清应平衡到室温。同时避免血清冷冻，反复冻融会使血清产生沉淀。

7. 如出现玻璃瓶破损、变形或包装损坏的情况，不要使用该试剂。