1.荧光光谱仪简介

  荧光光谱仪又称荧光分光光度计，是一种检测物质的定性、定量分析仪器。 其原理是根据荧光效应：激光照射原子，原子中电子吸收能量跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态， 但这些激发态是不稳定的，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放 ，产生荧光，一般持续发光时间短于10^-8秒（同时产生的磷光持续时间大于10^-8秒）。 通过荧光光谱仪的检测，可以获得物质的激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光强度、荧光寿命、斯托克斯位移、荧光偏振与去偏振特性，以及荧光的淬灭方面的信息。荧光光谱分析技术常应用于生物研究、制药分析、化工分析、食品检测、医学检验、环境监测、矿物分析等。

2.荧光光谱仪分类

按荧光原理可分：原子荧光光谱仪、分子荧光光谱仪和X射线荧光光谱仪等。

• 原子荧光光谱仪是通过测量待测元素的原子蒸气在辐射能激发下所产生的荧光发射强度,来测定待测元素含量的仪器。原子荧光激发光源一般为高强度空心阴极灯或无极放电灯一般原子荧光光度计用来对各类样品中痕量的铅、汞、砷、锗、锡、硒、碲、铋、锑、锌、镉的等无机元素定性和定量分析，通常用于环境监测，矿物鉴定等 。

• 分子荧光光谱仪是利用某些物质被紫外光或可见光照射后所产生的,并且能够反映出该物质特性的荧光,对其进行定性和定量的分析。分子荧光激发光源一般为是氙灯或高压汞灯。一般用来测定主要是含有共轭不饱和体系的化合物，如含有机分子的物质，通常用生物医学研究，制药，化工等领域。

• X射线荧光光谱仪的发射源是Rh靶X光管，有两种基本类型：波长色散型（WD-XRF）和能量色散型（ED-XRF）。其主要用于金属元素的测定，在环境科学、高纯物质、矿物、水质监控、生物制品和医学分析等方面有广泛的应用。

  通用荧光光谱仪根据波长范围大致可分为3种：

• 基本型：在200-800 nm的紫外可见波段的稳态光谱仪。

• 扩展型：覆盖200-1700 nm波段的紫外可见-近红外稳态光谱仪。

• 综合型：覆盖上述两个波段，同时可测瞬态光谱的光谱仪。

3.荧光光谱仪先进分析方法（关系到配套软件）

• 同步荧光分析。它与常用荧光测定最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，即同步荧光光谱。步荧光分析具有光谱简单，谱带窄、分辨率高、光谱重叠少等优点，可提高选择性，减少散射光等的影响，非常适合多组分混合物的分析，在环境、药物、临床、化工等领域应用广泛。

• 偏振荧光分析。荧光体的荧光偏振与荧光各向异性值的测定，能够提供与荧光体在激发态寿命期间动力学相关的信息，因此荧光偏振技术被广泛应用于研究分子间的作用，例如蛋白质与核酸、抗原与抗体、蛋白质与多肽的结合作用等。

• 三维荧光分析。普通荧光分析所得的光谱是二维谱图，而描述荧光强度同时随激发和发射波长变化的关系谱图，就是三维荧光光谱。它可以提供比常规荧光光谱和同步荧光光谱更为完整的光谱信息，是很有价值的光谱指纹技术。三维荧光光谱可以作为光谱指纹技术在环境监测(溶解有机质的分布等)、临床化学(根据癌细胞荧光代谢产物的检测，区分癌与非癌细胞等)以及细菌鉴别等领域应用；也可用于光化学反应监测、多组分混合物的定性和定量分析等。

• 时间分辨荧光分析。由于不同分子的荧光寿命不同，可在激发与检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质得以分别检测，即时间分辨荧光分析。采用激光光源可以获得皮秒(ps)级的脉冲宽度，可用于测定大多数荧光物质的寿命，非常有助于生物大分子和基团作用的研究。该技术与荧光免疫分析结合形成了时间分辨荧光免疫分析法。

• 低温荧光分析。通常荧光分析都在室温下进行，荧光光谱为带光谱，由于自然界有许多有机化合物，其化学结构颇为接近，它们的光谱往往相互重叠，难以鉴别表征以及定量测定。随着温度的降低，介质黏度增大，荧光分子量子产率和荧光强度将增大。因此，在低温以及特殊条件下，荧光物质就能给出更易识别的的尖锐荧光光谱(“准线性光谱”)。这就有可能对样品中所含荧光体进行“指纹识别”，甚至有可能对混合物中某些特定组分进行定量测定。低温荧光分析可用于多环芳烃及衍生物的鉴别与定量、DNA加合物的分析等。

• 单分子荧光检测。单分子荧光分析是实现单分子检测最灵敏的光分析技术。单分子荧光检测的关键在于确保被照射的体积中只有一个分子与激光发生作用以及消除杂质荧光的背景干扰。单分子荧光检测可提供单分子水平上生物分子反应的动力学信息，分子构象以及构象随时间的变化，因此尤其在生命科学领域中具有广阔的应用前景，为生命科学提供了新的研究手段。

4.分子荧光光谱仪的优劣势

分子荧光光谱仪优势

• 制样简单，试样多数不需经过化学处理就可分析，且固体、液体试样均可直接分析。

• 分析速度快。虽然测定用时与测定精密度有关，但一般都很短，2～5分钟就可以测完样品中的全部待测元素。

• 多元素同时检出能力。可同时检测一个样品中的多种元素。一个样品一经激发，样品中各元素都各自发射出其特征谱线，可以进行分别检测而同时测定多种元素。

• 敏感度高，选择性好。荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2-3个数量级。分光光度法通常在 10-7 级 ，而荧光的灵敏度达10-9。

• 非破坏分析。在测定中不会引起化学状态的改变，也不会出现试样飞散现象。同一试样可反复多次测量，结果重现性好。

分子荧光光谱仪劣势

• 在经典分析中，影响谱线强度的因素较多，尤其是试样组份带来的光谱重叠等，所以对标准参比的组份要求较高。

• 难于作绝对定量分析,需要精确的标样做比较。含量（浓度）较大时，准确度较差。

• 对样品化合物有共轭性要求,应用不广泛.

5.分子荧光光谱核心技术

• 光源：由于荧光样品的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作为一种理想的激发光源应具备：足够的强度、在所需光谱范围内有连续的光谱、强度与波长无关(即光源的输出是连续平滑等强度的辐射)、稳定的光强。常用的光源主要有氙灯，激光器等。

• 探测器： 荧光的强度通常比较弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。一般采用光电倍增管(PMT，如单光子技术，常见于高端)， CCD（中低端）和二级阵列管等（低端）。

• 分光系统（棱镜/光栅）：荧光光谱仪中单色器一般为光栅或滤光片，需要两个，一个用于选择激发光波长(激发单色器)，一个用于分离选择荧光发射波长(发射单色器)。

• 整体设计：如防止光电干扰光路和电路系统设计，模块化可升级设计，样品池开放性设计，配套软件等

6.分子荧光光谱关键技术指标

• 荧光光谱仪的光谱分辨率。光谱分辨率是指把光谱特征、谱带分解成为分离成分的能力。高级的荧光光谱仪分辨率可达0.5～1nm。

• 荧光光谱仪的频谱范围。高级的荧光光谱仪可覆盖200nm～1500nm。

• 荧光光谱仪中的波长准确度和波长重复性。波长准确度，是指波长的实际测定值与理论值(真值)的差，高端仪器的波长准确度可达0.1nm。波长重复性与波长准确度一样重要，是光谱仪可靠性的标志，高端的仪器可达0.1nm。

• 荧光光谱仪中的信噪比(S/N)。 一般水的拉曼S/N测试方法是把体系的灵敏度(信号存在)和体系噪音(信号不存在)的数据同时获取并进行比较，显示了仪器的综合性能。较好的拉曼S/N可达6000：1。

7. 影响分子光谱仪技术指标的关键因素

• 光源 ：荧光强度基本随激发光强度增强而增强，因此，高能闪烁氙灯的使用大大提高了灵敏度。脉冲氙灯只在测量时闪烁，一方面延长了灯的寿命，另一方 面避免了连续光源长时间照射引起的光敏样品的光降解和生物 样品。

• 探测器：PMT光电倍增管信噪比大，每个通道只能读取分立式谱，灵敏度高，疲劳恢复快。CCD面阵式检测噪音低，信号同步测定，可以读出一段光谱区域内的连续光谱CCD，但CCD在响应速度、温度稳定性等方面却不如PMT。一般以PMT为探测器的光谱仪价格高于CCD光谱仪，常见于以单光子技术为基础的高端仪器。

• 分光系统 （棱镜单色器/光栅单色器）,一般光栅单色器分辨率较高。另外,分光系统的中的狭缝，是影响分辨率和控制色散的关键因素。优秀的光谱仪如PE，激发狭缝为2.5nm，步进为0.1nm。但狭缝也需要和整个系统匹配，如果狭缝小到严重影响该光电响应的灵敏度，也就导致光子信号太弱而无法形成有效光谱。

• 样品池, 荧光仪用的样品池需用低荧光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形状以方形和长方形为宜。

• 样品本身，如化合物组合的复杂程度，共轭分子间元素和形态相似性等，还有溶液的PH值，温度等。

• 非线性：荧光发射与吸收在一定区间内呈线性关系，如果样本量太大或光路角度没有最优等其他因素导致两者关系超出线性范围，就会对量性判定造成很大误差。