其检测原理如下：

  将磷酸化底物进行荧光标记，蛋白激酶产生的磷酸化产物不进行荧光标记。让两种磷酸化产物与抗丝氨酸抗体（丝氨酸和苏氨酸是最常见的磷酸化位点,因为其结构末端含有羟基,羟基很活泼,可以与磷酸基结合）相竞争结合。当反应液中没有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，荧光标记的磷酸化与抗体相结合形成复合体，由于复合体较大，运动速率相对较小，受偏振光激发后产生的激发光具有较大的偏振值；当反应液中含有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，因二者竞争抗体的结合位点，结合到抗体上的荧光标记物较少，游离的荧光标记物在反应液中很多，发出的激发光偏振值减小。当蛋白激酶的活性越强，产生的磷酸化产物也就越多，与荧光标记物的竞争越激烈，对标记物产生的激发光的性质影响越大，因此偏振的改变直接与蛋白激酶的活性相关。利用这一原理可以检测蛋白激酶活性。

  当然，荧光偏振技术的运用远不仅于此，可以用来进行对单核苷酸多态性的筛选、参与实时荧光定量 PCR-FP 技术、进行核酸结构变化研究、进行体外细胞损伤检测等。还可以与免疫技术结合，成为荧光偏振免疫技术，用来检测金属离子、微量药物浓度、毒物检测等。