1、引物设计：获得弯曲菌的16srRNA基因，空肠弯曲菌mapA基因，结肠弯曲菌ask基因和胎儿弯曲菌cstA基因的特异性序列，基于软件Primer5.0工具设计引物。

2、细菌基因组DNA的提取

制备空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌的 DNA 模板。在准备的 CCDA 平板上接种，42℃ 微需氧环境下培养二天后选择5个菌落，加入到 0.1mL灭菌去离子三蒸水(SW)中且充分吹打均匀，沸水煮10min，取出后放置在冰上，8000r/min高速离心5min，将上清液转移到-20℃条件下保存，取菌株 DNA 进行特异性及灵敏度检测。

3、多重PCR扩增条件优化

PCR体系(20μL)中各成分的量如下：2xTaqMastermix10μL，引物各1μL，DNA模板溶液2μL，按要求加入后离心15s，收集反应物后进行扩增。

对体系最适退火温度进行摸索，PCR反应程序设置为：95℃15min，95℃30s，50-60℃(8个梯度进行梯度PCR)90s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃低温条件下保存。

电泳鉴定：根据分子量大小配制1.0%琼脂糖溶液，然后取出其中8μL扩增所得产物点样，以 DNAMarkerDL2000 作对照，100V 恒压电泳 40min后取出凝胶，通过凝胶成像软件观察结果。

4、多重 PCR 特异性检测

使用建立的PCR体系对空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌以及大肠杆菌、沙门氏菌等 11株参考菌株进行检测分析，凝胶电泳后 UV成像观察并对扩增情况进行分析。

5、多重 PCR 灵敏度检测

通过分光光度计测定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和胎儿弯曲菌的 DNA 抽提液，且据此测定 DNA 含量，进行 10倍梯度稀释处理，获得系列梯度稀释液，各取2μL 分别进行扩增，对条带亮度进行观察，直到不出现扩增条带为止。