弯曲菌分离培养检测试剂盒（粪便样本）   /   弯曲菌分离培养检测试剂盒（食品样本）

1、操作方法：

①样本处理

以禽肉为例：取分割禽肉（大于 250g，适当分割成若干块）或整禽放入无菌自封袋中，加入适量 BPW 培养液（即 10 倍稀释后的 BPW 母液）淹没样本（一般每 1 kg 样本加入 500mL BPW），以 100 r/min 的速度震荡 15min, 无菌操作取出禽肉（低温冷藏过夜浸泡后取出畜肉，检出效率更高），盥洗液用于检测。

（BPW母液：10倍稀释后使用）

以粪便为例：将沾有粪便的棉签或者肛拭子直接溶于试剂盒提供的2ml的弯曲菌促生长增菌培养液中，充分混匀，松开瓶盖， 37℃或者42℃微需氧环境，增菌培养24h。

注意：弯曲菌需要微需氧培养，沾有粪便的棉签或者肛拭子尽量全部插入液体内。标本建议 4h 内进行分离培养检测。

（Cary-Blair运送培养基）

②增菌培养：取 2ml 的盥洗液加入到弯曲菌增菌培养液中(4ml)，充分混匀，置于微需氧环境下（5% O2、10% CO2和 85% N2），不同培养温度增菌 24h 用于检测。

注意：将促生长增菌液摇匀，然后螺口拧松，于微需氧环境下 37℃或者 42℃ 增菌培养 24h；微需氧环境可由下列几种方式提供，当使用密闭盒方式培养时，需注意微需氧产气包的规格型号需与密闭盒的容积相对应，例如当使用 2.5L 密闭盒时，需要使用 2.5L 微需氧产气包。

（ 促生长增菌液 /    智能厌氧微需氧培养系统（配备弯曲菌专用培养罐） /     微需氧产气包 ）

③双孔滤膜法培养：无菌操作，将滤膜轻轻贴在平板的中央表面（有网格面向上），注意不要产生气泡（可用弯头镊子轻轻让膜与平板充分接触）。取 250ul-300ul 样本悬液分 5 点～7 点滴于两个孔中的滤膜上，培养基平面朝上搁置 45-60min，弃滤膜。37℃微需氧条件倒置培养 48h。

（ 双孔板培养基  /       弯曲菌选择性滤膜 ）

注意事项：

1. 在贴膜揭膜过程中，要全程保持镊子无菌。贴膜时，蓝色网格面向上，随后蓝色保护膜会自动卷曲翘起，将蓝色薄膜取出丢弃。

2. 加样前震荡或吹打充分混匀标本。

3. 所加液体不能溢出滤膜边缘，否则实验失败。

4. 静置时间应足够长（45min 以上），待弯曲菌充分透过滤膜后，方可揭去滤膜。

④菌落鉴定（镜检、生化鉴定、PCR鉴定）

镜检：

菌落形态：初次分离培养 2~3 天菌落不溶血，扁平，湿润、有光泽，边缘完整，发亮；5~6 天后菌落增大颜色灰白、扁平、菌落不溶血。

取双孔板滤膜印迹内 3-4 个疑似菌落，进行涂板于微需氧环境中纯化培养。（无须划线培养，直接挑取单菌落；纯化培养以满足后续鉴定所需要的菌量，推荐使用如下哥伦比亚血平板或Karmali 平板）

生化鉴定：

挑取合适菌量的纯培养细菌进行氧化酶试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验和吲哚乙酸酯水解试验，进行初步鉴定。

（弯曲菌生化检测试剂盒 20T/盒）

PCR核实鉴定：

弯曲菌五重核酸检测试剂盒（探针法）   /          弯曲菌六重核酸检测试剂盒（探针法）

⑤弯曲菌的保存及运输

保存：

将鉴定后的单菌落进行增菌，用无菌接种环（或者棉拭子）将平板上的所有菌苔全部收集，均匀悬浮于盛有弯曲菌保存培养基、保存液的冻存管中，-80 ℃冷冻保存或者液氮保存。

（注意：不可菌量少而保存液过多，一般满菌环的菌量需要 0.5ml 的保存液）

运输：

运送前，将弯曲菌运输培养基从 4 ℃冰箱中取出平衡至室温，用无菌接种环收集生长旺盛菌苔（10ul 接种环，满环），将收集好菌的接种环直接插入弯曲菌运输培养基中部，缓慢取出接种环（注意取出接种环后，尽量让细菌保留在运输培养基的中部！），拧紧管盖，进行保鲜运输（4℃运输）或者室温运输（不超过 7 天），2周内皆可100%复苏。

（ 菌种保存液    /    菌种运输培养基 ）

⑥PCR分型

（ 格林-巴利综合征高风险空肠弯曲菌血清筛查试剂盒（9类11种）/ 空肠弯曲菌十种毒力基因多重核酸检测试剂盒（探针法））