（五）染料抑菌试验

1、原理：不同种型布鲁氏菌对某些染料活跃的还原系统表现出不同的还原能力，在一定浓度不同染料环境中可生长或被抑制，因此,可根据不同染料对不同种型布鲁氏菌抑制情况作为种型鉴定依据。

2、试验材料、试剂制备

3、(1)硫堇、碱性复红基础液配制:

称取硫堇和碱性复红各0.1g,分别放入研磨钵中仔细研磨,然后加少许无水乙醇再仔细研磨。每种颜料共加无水乙醇20ml,把颜料分别洗人棕色瓶中,塞紧瓶塞,室温下放置2~3天,每天振摇数次,使颜料充分溶解,然后各瓶加蒸馏水至100ml,充分混 匀。  即为1:1000的硫堇和1:1000的碱性复红溶液。将一定数量直径5mm高压灭菌的滤纸片放在盛有硫堇和碱性复红基础液中浸泡2天后取出,在灭菌的平皿中分散摊开,置37℃温箱中烤干收取备用。置4℃冰箱保存备用,可长达数年。

注:每个厂家的染料所用浓度可能会不同,所以制好的滤纸片应用标准菌进行检测后方可使用。

(2)布氏肉汤半固体培养基配制

布氏肉汤培养基(生产商:BD):28g、琼脂粉:7g、蒸馏水:1000ml，煮沸使琼脂充分融解,分装玻璃试管,根据使用平皿大小确定分装量,一般实验使用 90mm 规格的平皿可分装10m1的量,高压灭菌后保存备用。

4、操作方法：

  (1)在布氏琼脂平皿底面分区标记硫革、复红

  (2)融化布氏肉汤半固体培养基,置于50℃水浴中备用；

  (3)使用移液器吸2m1生理盐水移至5m1Felcon管,用接种环分别挑取适量24~48小时的培养物至Felcon管,在管壁研磨,用混旋器混匀,制备菌悬液10亿菌体/m1(麦氏浊度=1.4),用记号笔在Felcon管标记菌株名称。

  (4)使用移液器吸取100uL菌悬液,加入到50℃水浴的半固体培养基中混匀,将混匀后的菌悬液-半固体培养基倒入布氏琼脂培养基平皿中铺平,待其凝固。

  (5)分别将硫革、复红染料滤纸片轻放在凝固后相应标记的双层培养基表面,放培养箱 37℃培养,24~48 小时后观察结果。

5、结果判定：

细菌生长受到染料抑制时,染料滤纸的周围无菌生长,判定为阴性。细菌生长不受染料抑制时,染料滤纸的周围有菌生长,判定为阳性。