1.试剂影响

这是我们首先应该确保的，我们使用的试剂必须是有效的。实验室应当建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存放、使用、过期后的废弃处理都应有严格规定，确保我们使用的试剂是有效的。工欲善其事必先利其器，这也是我们试验成功最基础的一环。

2.染色菌的选择 

菌龄对革兰氏染色结果的影响是十分大的。

我们染色过程中选择的菌应该是处于活跃生长期，这样的细菌活性强，生理特征明显，所以染色的结果准确度高，一般情况下不会出现误差。培养时间较长的革兰氏阳性菌，由于细胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已经死亡或者自行溶解了，造成细胞壁通透性增加，就会呈现出假阴性。

3.涂菌的状态

在染色最初的涂布中，在挑取菌体后应该在无菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布过程中，若是菌体堆积，也会极大影响染色结果的准确性。菌落堆积过多，往往菌体之间变得毫无缝隙，而其细胞壁的成分影响造成了脱色的情况不佳，容易产生假阳性的结果。

同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染液覆盖整个菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌没有染色。因此在涂片过程一定要将菌膜涂得少而均匀，这样才能达到最佳效果。

4.媒染时间

媒染时间对革兰氏阴性菌的染色结果有很大影响。

由于媒染时间过长，结晶紫在碘液长时间作用下过分牢固结合在菌体细胞壁上，影响了酒精的脱色效果，从而会导致这种假阳性的效果。

5.酒精脱色

酒精脱色也是一个对结果影响较大的操作过程。

革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌最主要的差异是细胞壁肽聚糖层厚度和结构，革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层很薄，脂多糖含量高因此在酒精脱色时，细菌细胞壁的多糖成分会被酒精溶解，增大了细胞壁的通透性，结晶紫及碘复合物就很快被酒精洗脱，之后就会被沙黄复染呈红色；而阳性菌肽聚糖层厚，脂多糖少，酒精只能起到脱水效果而无法进入，这样结晶紫和复合物就无法洗脱出来使细胞呈紫色。

因此，酒精脱色时间短，脱色效果不佳，会导致阴性菌菌体内的结晶紫和复合物不能有效的全部洗脱出来，就会出现明显的误差，使阴性菌出现假阳性。而洗脱时间过长，也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏，导致细胞内的紫色被洗脱，呈现假阴性。因此洗脱时间也是革兰氏染色的关键环节。洗脱时间应当严格控制在20s-30s之间，同时保证洗脱效果。