1.序列选取应在基因的保守区段。

2.Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp。

3.避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,4.避免引物自身形成环状发卡结构。

5.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%。

6.引物之间的Tm值相差避免超过5°℃。

7.引|物的3’端避免使用碱基A。

8.引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

9.为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

10.探针位置尽可能地靠近上游引物。

11.探针长度通常在25~35bp，Tm值在65~70°℃,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%。探针的5"端应避免使用碱基G。

12.整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。

13.为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区建议重新设计引物探针

PCR常用的应用场景就是基因检测，包括医疗诊断，环境微生物检测，转基因检测等检测病原体、基因突变、基因融合、拷贝数变异等。