实验菌种：金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种芽胞ATCC9372、白色葡萄球菌8032，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。

1、细菌繁殖体悬液的制备

①以无菌操作方式开启菌种管，用毛细吸管加人适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 mL~10.0 mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置 36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h。或从菌种保存管中取出一粒菌珠接种于平皿上，置 36 ℃士1℃培养 18 h~24 h，挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，置 36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h，即为第3代培养物。

②取第3代~第8代的营养琼脂培养基培养 18 h~24h的新鲜斜面培养物，用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 mL~5.0 ml,稀释液(一般用 TPS酸化水用生理盐水)加人试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0 mL吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合 20s或在手掌上振打 80 次，以使细菌悬浮均匀。

③初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需浓度。

④细菌繁殖体悬液应保存在4℃ 冰箱内备用。应当天使用，不得过夜。

⑤怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

2、细菌芽胞悬液的制备

①以无菌操作方式开启菌种管，用毛细吸管加人适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 mL~10.0 mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置 36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h，挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置 36 ℃士1 ℃培养 18 h~24 h，即为第 3代培养物。

②用 10.0 ml吸管吸取 5.0 mL~10.0 mL第3代~第5代的 18 h~24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置 36 ℃士1 ℃恒温培养箱内培养 5 d~7 d。用接种环取菌苔少许涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。

改良芽胞染色法步骤如下：a)用接种环取菌苔涂布于玻片上，待自然干燥，而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。b) 将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.00%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放 54 ℃~56 ℃条件下加热 30 min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液。加 0.5%沙黄水溶液，染1 min。水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽胞形成率达 90%以上时，即可进行后续处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。

③加 10.0 ml无菌蒸馏水于罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇5 min。将烧瓶置 45 ℃水浴中 24 h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除琼脂凝块。

④将芽胞悬液置无菌离心管内，以 3000 r/min 速度离心 30 min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮，本步骤重复3遍。将洗净的芽胞悬液放人含适量小玻璃珠的烧瓶内，80 ℃水浴10 min(或 60 ℃水浴 30 min)，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装保存于4℃冰箱中备用。有效使用期半年。

⑤芽胞悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。